单宁和氧化锌对断奶仔猪粪便菌群、 血清抗氧化及肝脏功能指标的影响

作者：陶勇，杨晓志，王见悠，徐斌，任善茂，孙清平 

摘 要：本试验旨在研究单宁和氧化锌不同水平组合对断奶仔猪粪便菌群及血清免疫、抗氧化和肝脏功能相关血液生化指标的影响。选用体重相近， ２５日龄杜×长×大断奶仔猪２７０头，随机分成９组，每组３个重复，每个重复１０头猪。对照组饲喂基础日粮加高锌（ ３　０００ｍｇ ／ｋｇ氧化锌）的日粮，试验１～８组（ Ｔ１～Ｔ８ ）分别饲喂基础日粮添加以下氧化锌与单宁组合的日粮：（ ２　０００＋０ ）、（２　０００＋１　０００ ）、（ １　０００＋０ ）、（ １　０００＋１　０００ ）、（ １　０００＋１　５００ ）、（ １　０００＋２　０００ ）、（ ０＋１　５００ ）、（ ０＋２　０００ ）ｍｇ／ｋｇ 。试验期３０ｄ。分别于试验的第１４与２８天采集仔猪新鲜粪样，测定粪便中各细菌的数量。试验结束采集血样，测定血清免疫、抗氧化及肝脏功能相关指标。结果显示，试验第１４天，各组断奶仔猪粪便大肠杆菌、乳酸菌和双歧杆菌数量均无显著差异（ Ｐ ＞０．０５ ）。试验第２８天， Ｔ１ 、 Ｔ６组断奶仔猪粪便乳酸菌数量极显著高于对照组（ Ｐ ＜０．０１ ），而双歧杆菌数量则显著高于对照组（Ｐ ＜０．０５ ），但各组大肠杆菌数量均无显著差异（ Ｐ ＞０．０５ ）。各组断奶仔猪血清中 ＩｇＧ 和 ＩｇＡ 含量、ＭＤＡ 含量及 ＧＳＨ － Ｐｘ 活力均无显著差异（ Ｐ ＞０．０５ ）。但 Ｔ５ 、 Ｔ６ 、 Ｔ７ 、 Ｔ８ 组断奶仔猪血清 ＧＳＨ 含量极显著高于对照组（ Ｐ ＜０．０１ ）。除了 Ｔ２ 和 Ｔ５ 组，其余各组猪血清谷草转氨酶活性均显著或极显著低于高锌对照组（ Ｐ ＜０．０５ ； Ｐ ＜０．０１ ）。本试验结果表明，与单一使用高剂量氧化锌相比，单宁与氧化锌适量水平组合有利于乳酸菌及双歧杆菌的增殖、提高断奶仔猪抗氧化能力并对肝脏产生保护作用。

仔猪早期断奶应激综合征一直是养猪生产中的重要问题，其常见临床表现为腹泻、采食量下降、生长停滞、抗病力下降等 。为了减缓断奶应激综合征，在断奶仔猪饲料中常采用高剂量的氧化锌同时添加抗生素。高剂量氧化锌的使用增加了粪便中锌的含量，粪便直接还田后其所含的锌却不能被降解 ，因而产生了严重的环境污染。而猪饲料中长期大剂量添加抗生素也会产生耐药性、畜产品药物残留等一系列问题。面对中国发展绿色环保、低抗甚至无抗养殖的新形势，断奶仔猪生产中亟需寻找新型的绿色饲料添加剂以降低仔猪腹泻、提高仔猪抗病力。

单宁是一种天然的植物多酚，包括聚合单宁和水解单宁，其广泛分布于植物中。大麦、高粱、油菜籽及蚕豆中富含单宁，并主要以聚合形式存在。传统动物营养中单宁作为抗营养物质被人们所熟知，已知聚合单宁及水解单宁均具有抗营养作用。饲料中高含量的单宁会影响饲料的适口性，降低饲料中能量、粗蛋白质、矿物质和氨基酸的消化率 ，从而降低动物生长性能 。现代动物营养中体外研究表明，单宁对多种有害微生物均具有抑制或杀灭作用，可作为潜在的抗菌促生长剂。动物试验也表明，猪饲料中低剂量单宁可有效控制腹泻。迄今为止，仅见断奶仔猪饲料中单一使用单宁或高剂量氧化锌的研究，而单宁与氧化锌组合使用对断奶仔猪作用的研究鲜有报道。本试验通过在断奶仔猪日粮中将单宁与氧化锌组合使用，研究其对粪便菌群、血清免疫指标、抗氧化指标及肝脏功能相关生化指标的影响，以确定国内养殖条件下断奶仔猪日粮中单宁及氧化锌组合使用替代高剂量氧化锌的可行性。

１材料与方法
１．１　材料
迈多芬－单宁由迈特多（江苏）生物技术有限公司提供，含量 ≥８５％ ，全植物源性产品，部分水解。大肠杆菌测定用结晶紫中性红胆盐琼脂、乳酸菌测定用 ＭＲＳ培养基及双歧杆菌测定用双歧杆菌琼脂培养基均购自北京陆桥技术股份有限公司；免疫球蛋白 Ｇ （ ＩｇＧ ）测定试剂盒、免疫球蛋白 Ａ （ＩｇＡ ）测定试剂盒、丙二醛（ ＭＤＡ ）测定试剂盒（ＴＢＡ 法）、还原型谷胱甘肽（ ＧＳＨ ）测定试剂盒（微板法）及谷胱甘肽过氧化物酶（ ＧＳＨ － Ｐｘ ）测定试剂盒（比色法）均购自南京建成生物工程研究所。酶标仪（型号为ＳＨ －１０００ ）购自日本日冠电气公司。

１．２ 试验设计

试验猪由江苏省扬州市三生畜牧有限公司提供。选用健康的体重相近的２５日龄杜×长×大断奶仔猪２７０头，随机分成９组，每组３个重复，每个重复１０头猪。各组猪初始体重差异不显著（ Ｐ ＞０．０５ ）。基础日粮中含锌１４０ｍｇ ／ｋｇ，对照组（ Ｃ ）日粮为基础日粮加高锌（３０００ｍｇ／ｋｇ氧化锌），试验组１～８组（ Ｔ１～Ｔ８ ）日粮为基础日粮中分别添加以下氧化锌与单宁组合：（２　０００＋０ ）、（ ２　０００＋１　０００ ）、（１　０００＋０ ）、（ １　０００＋１　０００ ）、（ １　０００＋１　５００ ）、（１　０００＋２　０００ ）、（ ０＋１　５００ ）、（ ０＋２　０００ ）ｍｇ／ｋｇ。基础日粮组成及营养水平见表１ 。试验期为３０ｄ 

１．３ 动物饲养管理
饲养试验于２０１８年４月 ～２０１８年５月在扬州迈特多（江苏）生物技术有限公司试验猪场进行。试验猪自由采食及饮水。按饲养场正常饲养管理程序和防疫程序进行管理，所有试验猪饲养管理条件均相同。

１．４ 测定指标及测定方法
１．４．１ 粪便微生物测定 　　 
将采样用５ｍＬ试管及宽嘴镊于１２１ ℃高压灭菌２０ｍｉｎ后烘干备用。分别于试验的第１４ 、 ２８天从每个重复中随机选择两头猪，即每个处理６头，每头猪采集约３ｇ 新鲜粪便置于试管内，并迅速放入冰盒中保存。采样结束后，将存有粪样的试管放入４℃冰箱保存，并于２４ｈ内完成测定。按培养基说明书制备大肠杆菌、乳酸菌、双歧杆菌培养基。用常规方法检测粪便中的大肠杆菌、乳酸菌、双歧杆菌的数量，每个样品做３个重复，结果以ｌｇＣＦＵ ／ ｇ 表示。
１．４．２ 血清免疫指标测定 　　 
试验结束，每个重复随机选择两头猪，即每个处理 ６ 头猪，前腔静脉采血， ３　７００ｒ ／ ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ ，取上清于－２０℃保存，待测。通 过 ＥＬＩＳＡ 试剂盒测 定 血 清ＩｇＧ 和ＩｇＡ 的含量，酶标仪测定 ４５０ｎｍ 处的吸光度，并用 ＥＬＩＳＡｃａｌｃ软件计算结果。
１．４．３ 血清抗氧化指标测定 　　 
使用试剂盒，通过硫代巴比妥酸法检测血清中 ＭＤＡ 含量，微量酶标法检测血清 ＧＳＨ 含量，并测定血清中 ＧＳＨ －Ｐｘ活力。
１．４．４ 肝脏功能相关的血清生化指标测定 　　 
采用血清生化测定仪测定血清中的总蛋白（ ＴＰ ）、白蛋白（ ＡＬＢ ）、球蛋白（ＧＬＯ ）含量及谷丙转氨酶（ ＡＬＴ ）和谷草转氨酶（ ＡＳＴ ）活性。

１．５ 数据分析
采用Ｅｘｃｅｌ对数据进行初步整理。使用 ＳＰＳＳ２０．０ 软件中的单因素方差分析（ Ｏｎｅ －ＷａｙＡＮＯ －ＶＡ ）进行分析， Ｄｕｎｃａｎ氏法进行多重比较。结果均以平均值±标准误表示，以 Ｐ ＜０．０５为差异显著性判断标准，以 Ｐ ＜０．０１为差异极显著性判断标准。

２　 结果
２．１　 单宁和氧化锌不同水平组合对断奶仔猪粪便菌群的影响

由表２可知，试验第１４天各组断奶仔猪粪便中大肠杆菌、乳酸菌和双歧杆菌数量均无显著差异（Ｐ ＞０．０５ ）。试验第２８天，各组断奶仔猪粪便中大肠杆菌数量仍无显著差异（Ｐ ＞０．０５ ）；但 Ｔ３组断奶仔猪粪便乳酸菌数量显著高于对照组（ Ｐ ＜０．０５ ），Ｔ１ 、 Ｔ２ 、 Ｔ５ 、 Ｔ６组断奶仔猪粪便乳酸菌数量极显著高于对照组（ Ｐ ＜０．０１ ），其他各试验组与对照组相比均无显著差异（ Ｐ ＞０．０５ ）；Ｔ１ 、 Ｔ６组断奶仔猪粪便双歧杆菌数量显著高于对照组（ Ｐ ＜０．０５ ），Ｔ４组极显著高于对照组（ Ｐ ＜０．０１ ），其他各试验组与对照组相比均无显著差异（Ｐ ＞０．０５ ）。

２．２ 单宁和氧化锌不同水平组合对断奶仔猪血清

免疫指标的影响由表３可知，各组断奶仔猪血清中ＩｇＧ 和ＩｇＡ含量均无显著差异（Ｐ ＞０．０５ ）。

２．３ 单宁和氧化锌不同水平组合对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响

由表４可知，各组断奶仔猪血清中 ＭＤＡ 含量及 ＧＳＨ －Ｐｘ活力均无显著差异（ Ｐ ＞０．０５）。但 Ｔ５、Ｔ６ 、 Ｔ７ 、 Ｔ８组断奶仔猪血清 ＧＳＨ 含量极显著高于对照组（ Ｐ ＜０．０１ ），其他各试验组与对照组相比均无显著差异（ Ｐ ＞０．０５ ）。

２．４ 单宁和氧化锌不同水平组合对断奶仔猪肝脏功能相关的血清生化指标的影响
由表５可知，各组断奶仔猪血清中总蛋白、白蛋白和球蛋白含量无显著差异（ Ｐ ＞０．０５ ），血清白球比和谷丙转氨酶活性亦无显著差异（Ｐ ＞０．０５ ）。 Ｔ３和 Ｔ４组谷草转氨酶活性均显著低于高锌对照组（Ｐ ＜０．０５ ）， Ｔ１ 、 Ｔ６ 、 Ｔ７和 Ｔ８组谷草转氨酶活性则极显著低于高锌对照组（Ｐ ＜０．０１ ）。

３　 讨 论
３．１　 单宁与氧化锌不同水平组合对断奶仔猪粪便菌群的影响
单宁存在于多种植物的皮与籽实中，其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌等致病菌均具有抑 制和杀灭作用 ，在仔猪饲料中添加单宁可有效控制腹泻。单宁控制仔猪腹泻与其抑菌及杀菌作用有关。单宁抑菌作用的机制可能是由于其可抑制胞外细菌酶的分泌，剥夺微生物生长所需的底物或通过氧化磷酸化作用直接作用于微生物代谢。单宁与铁结合的能力 被 认为 是单 宁 抑 菌 特 性 的 机制。在１５ｋｇ仔猪基础日粮中添加１　０００ｍｇ／ｋｇ坚木单宁２８ｄ后降低了猪粪便中大肠杆菌数量。在２１ｄ断奶仔猪饲料中添加不同剂量的（１２５～１　０００ｍｇｋｇ ）单宁发现，试验第 ２周随着日粮中单宁添加量的升高，粪便中大肠杆菌数量下降，而在试验的第４周，未见单宁的添加对粪便微生物的显著影响。本研究中试验第２周，不同氧化锌与单宁组合日粮均未对粪便各微生物数量产生影响，但在试验第 ４ 周氧化锌与单宁组合为（１　０００＋２　０００ ）ｍｇ／ｋｇ组及（２　０００＋０ ）ｍｇ／ｋｇ组粪便中乳酸菌和双歧杆菌的数量均显著高于高锌对照组，但各组大肠杆菌数量差异不显著。这与高锌降低断奶仔猪粪样中乳酸杆菌种群数量的结论一致  。以上结果表明，氧化锌与单宁组合后对大肠杆菌抑菌作用与使用高锌（３　０００ｍｇ／ｋｇ氧化锌）相当，但对乳酸菌及双歧杆菌的作用相当或优于高
锌，其作用取决于单宁与氧化锌的组合剂量。

３．２　 单宁与氧化锌不同水平组合对断奶仔猪血清免疫指标的影响
单宁 对 猪 免 疫 机 能 影 响 的 研 究 较 少。在生长猪饲料中添加０．５％的单宁发现，饲喂４２ｄ 后与基础日粮组相比，提高了血清 ＩｇＧ 和 ＩｇＭ含量，但未影响ＩｇＡ 含量。而高锌对断奶仔猪免疫机能影响的研究相对较多。在断奶仔猪日粮中添加３　０００ｍｇ／ｋｇ氧化锌发现，与对照组相比添加高锌２１ｄ后可提高血清中ＩｇＭ 含量。在断奶仔猪日粮中添加３　００ｍｇ／ｋｇ氧化锌，试验２８ｄ后与对照组相比提高了血清ＩｇＡ 和ＩｇＧ含量，但未影响ＩｇＭ 含量。免疫球蛋白的差异可能与两试验测定时间不一致有关，但均表明高锌提高了断奶仔猪体液免疫。本试验中各试验组猪血清中ＩｇＧ和ＩｇＡ 含量与高锌对照组相比均无显著差异，表明单宁与氧化锌组合使用后对断奶仔猪体液免疫作用与使用高锌相当。

３．３　 单宁与氧化锌不同水平组合对断奶仔猪血清抗氧化指标的影响
氧化是引起动物生产性能异常和疾病的重要内源性 因 素。而 植 物 多 酚 类 物 质 则 主 要 通 过 激 活Ｎｒｆ２ ／ ＡＲＥ信号通路，调节机体内抗氧化酶基因的表达，提高抗氧化酶的活性；或增加机体的抗氧化剂如维生素 Ｅ 、维生素 Ｃ 的含量，从而增强动物机体的抗氧化能力。但不同结构、不同性质的多酚对信号通路的调控作用不同，对抗氧化酶活性的影响也有很大差别  。单宁是天然的植物多酚，含有多羟基结构，多 个 研 究 表 明 单 宁 具 有 较 强 的 抗 氧 化 能力  ，而且单宁抗氧化能力的强弱与其来源有关 。断奶仔猪日粮中添加高锌也可提高抗氧化酶如ＣｕＺｎ － ＳＯＤ及 ＧＳＨ － Ｐｘ的活性，从而提高机体抗氧化能力 。本研究中降低日粮中氧化锌的添加量并添加单宁，未影响 ＧＳＨ － Ｐｘ 活性和 ＭＤＡ含量，但有 ４ 组单宁添加组猪血清 ＧＳＨ 含量比高锌对照组高。 ＧＳＨ 是机体抗氧化系统的重要组成部分，是 ＧＳＨ － Ｐｘ 、谷胱甘肽转移酶（ ＧＳＴ ）两种酶的反应底物，谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ － ｇｌｕｔａｍｙｌｃｙｓ －ｔｅｉｎｅ　ｓｙｎｔｈｅｔａｓｅ ， γ － ＧＣＳ ）是还原型 ＧＳＨ 合成的限速酶  。本试验中添加单宁后血清中 ＧＳＨ 含量上升，可能是由于单宁通过 Ｎｒｆ２通路，提高 γ － ＧＣＳ的含量和活性，促进 ＧＳＨ 的合成，从而增强机体的抗氧化能力。单宁与氧化锌组合使用后机体的抗氧化能力与使用高锌相当或优于高锌，具体效果与单宁与氧化锌的组合用量有关。

３．４　 单宁与氧化锌不同水平组合对断奶仔猪肝脏功能相关的血清生化指标的影响
血清中白蛋白和球蛋白含量、白球比、谷丙转氨酶及谷草转氨酶活性是综合评价肝脏功能的重要指标。本试验中与高锌对照组相比，降低断奶仔猪日粮中的锌水平并添加单宁降低了血清谷草转氨酶活性，但未对其他指标产生影响，这表明给断奶仔猪长期饲喂高锌日粮可损伤猪肝脏的正常功能，而降低锌含量并添加单宁则能保护肝脏。研究也证实了在断奶仔猪日粮中长期添加高锌对其肝脏功能的损伤作用，当断奶仔猪采食高锌４２ｄ时血清中谷丙转氨酶活性上升，持续采食到７０ｄ血清谷丙 转 氨 酶 和 谷 草 转 氨 酶 活 性 均 上 升。 使用高锌日粮饲喂断奶仔猪２８ｄ后发现，断奶仔猪肝细胞出现细胞质空泡，并同时伴有脂肪变性。肝脏具有处理并贮存日粮中高剂量锌的能力，当断奶仔猪日粮中添加高锌后其肝脏中锌含量将上升到对照组的４～５倍，甚至更高  。随着高锌添加时间的延长，肝脏中锌的蓄积量更高，长期添加高锌时肝脏锌含量可高达９５０ｍｇ／ｋｇ。当肝脏中锌的蓄积量达到一定水平时会对肝脏产生毒性；反之当降低日粮中锌含量并添加单宁时则肝脏锌沉积减少，即使长期添加其在肝脏中的蓄积量也未达到中毒剂量。

４　 结论

本试验结果表明，与单一使用高剂量氧化锌相比，单宁与氧化锌适量水平组合有利于断奶仔猪乳酸菌及双歧杆菌的增殖、提高机体抗氧化能力并对肝脏产生保护作用。

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