百里香酚对山羊子宫内膜上皮细胞的体外毒活性研究

摘要：为了探究百里香酚对山羊子宫内膜上皮细胞（ ｇｏａｔ ｅｎｄｏｍｅｔｒｉａｌ ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，ｇＥＥＣｓ）的毒性作用，采用不同浓度的百里香酚作用于 ｇＥＥＣｓ 后，观测其对细胞生长曲线，细胞形态学变化，以及细胞膜结构完整性的影响。 结果表明，百里香酚对 ＥＥＣｓ 的毒性作用与其浓度呈剂量依赖效应（ｙ＝ －０．００８ｘ＋１．２２０２，Ｒ ２ ＝ ０．９７６７），即随着药物浓度的增加细胞的增殖抑制率增大，药物对细胞的半数增殖抑制率（ＩＣ ５０ ）为 １００ μｇ／ ｍＬ。 当 ５０、１００ μｇ／ ｍＬ 的百里香酚作用于 ＥＥＣｓ 时， ｇＥＥＣｓ 的细胞核、细胞浆的形态均未产生明显变化，但当 １５０ μｇ／ ｍＬ 的百里香酚作用于 ｇＥＥＣｓ 时，细胞膜破裂，细胞死亡；而且药物浓度≥１００ μｇ／ ｍＬ 时细胞 ＬＤＨ 的释放量显著高于正常细胞组，ｇＥＥＣｓ 细胞膜的完整性受到破坏。 百里香酚作用于山羊子宫内膜上皮细胞后呈现一定的毒性作用，且毒性作用和药物的浓度有关。 百里香酚作用于 ｇＥＥＣｓ 的安全范围在 ０～１００ μｇ／ ｍＬ，研究结果为百里香酚治疗奶牛等经济动物的炎症性疾病的临床用药浓度提供理论依据。
关键词：百里香酚；子宫内膜上皮细胞；细胞毒性；膜通透性
作者：闫宝琪，张世栋，董书伟，王东升，那立冬，桑梦琪，杨洪早，严作廷

子宫内膜炎（Ｅｎｄｏｍｅｔｒｉｔｉｓ） 是奶牛的常见病之一，多发生于产后，是病原菌感染子宫内膜引起的炎症，常导致奶牛屡配不孕 ［１－２］ 。 该病可造成奶牛生理功能紊乱、产奶量下降，甚至终生不孕而被淘汰，给养殖户造成严重危害，经济损失巨大。 据中国奶牛协会统计，奶牛的繁殖障碍发生率高于其他牛，而且在不孕的病因中以子宫内膜炎引起的不孕牛所占比例最高 ［３，４］ 。 临床上，大量抗生素和激素应用于治疗子宫内膜炎，导致耐药菌株的不断产生，抗生素残留，治疗效率明显降低。 中草药具有明显的抗菌消炎，毒副作用小，增强免疫力，改善血液循环和增加子宫收缩的作用，所以近十几年来关于应用中草药治疗子宫内膜炎的研究成为热点 ［５－６］

百里香酚是一种单萜酚类物质，最初从百里草中分离而得名，即 ５－甲基－２－异丙基苯酚（５－ｍｅｔｈｙｌ－２－ｉｓｏ－ｐｒｏｐｙｌｐｈｅｎｏ１）［７］ 。 研究发现百里香酚具有广谱抗菌活性，对多种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌等均具有抑制作用 ［８］ 。 Ａｒａ⁃ｎｔｘａ Ａｚｎａｒ 等 ［９］ 研究发现将百里香酚、香芹酚和甲基混合后在 ２５ ℃ 下能够有效抑制酵母菌繁殖生长，抑制时间长达２１ ｄ。 Ｏｍｒａｎ 等的研究也发现，百里香精油对外阴道念珠菌有较强的抗真菌活性，其效果优于氟康唑，与 １ μｇ／ ｍＬ 的两性霉素 Ｂ 的抗真菌效果相当 ［１０］ 。 体外实验表明，百里香酚可以显著抑制低密度氧化脂蛋白诱导的人ＴＨＰ－１单核细胞促炎性细胞因子ＴＮＦ－α、ＩＬ－１β、ＩＬ－６ 并促进 ＩＬ－１０ 的基因和蛋白表达水平，对一些炎症类疾病如皮炎、胸膜炎、腹膜炎和风湿性关节炎等均具有抗炎促愈合功能 ［１１－１２］ 。

综上所述，百里香酚有较好的抑菌抗炎效果，对于一些炎症性疾病具有较好的应用前景，但应用百里香酚治疗奶牛等经济动物的子宫内膜炎的研究还未见报道。 近年来，利用子宫内膜细胞的体外培养检测子宫生理功能的研究不断呈现新的进展，同时利用 ＬＰＳ 刺激子宫内膜上皮细胞建立的炎症模型检测炎症信号通路以及中草药抗炎机制的报道也在不断增加 ［１３－１４］ 。 实验中，筛选出中草药作用于细胞无毒性作用的浓度是在分子细胞水平上检测中草药抗炎作用的前提条件。 因此，试验采用山羊子宫内膜上皮细胞（ｇＥＥＣＳ）作为材料，研究百里香酚对其的毒性作用，以期为百里香酚治疗奶牛子宫内膜炎的临床用药研究提供理论依据。

１　材　料
１．１．１　 细胞　 
山羊子宫内膜上皮细胞系（ＥＥＣｓ），由西北农林科技大学动物医学院靳亚平教授惠赠。
１．１．２　 主要仪器及设备　 
Ｍｅｍｍｅｒｔ ＣＯ２ 培养箱；ＨｅａＬ ＦｏｒｃｅＢ２ 型生物安全柜；ＳＷ－ＣＪ－１ＣＵ型超净工作台；倒置显微镜，Ｌｅｉｃａ ＤＭＩ６０００Ｂ；ＭＤＣ Ｍ２ｅ 型多功 能 酶 标 仪； 细 胞 培 养 瓶、 培 养 板 为 美 国ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ产品。
１．１．３　药品及试剂　 
百里香酚 （Ｔｈｙｍｏｌ， Ｂ２１１５３，１００ ｍｇ），用含 ０．０５％的 ＤＭＳＯ 将其稀释到所需要的浓度；ＤＭＥＭ／ Ｆ１２ 培养基为 Ｇｉｂｃｏ 公司产品；胎牛血清（ｆｅｔａｌ ｂｏｖｉｎｅ ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）为杭州四季青公司产品；０．０１ ｍｏｌ／ Ｌ 磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ，ｐＨ７．２～ ７．４）；ＭＴＴ 为 Ｓｉｇｍａ 公司产品以 ０．０１ ｍｏｌ／ Ｌ ＰＢＳ 溶解至 ５ ｍｇ／ ｍＬ；瑞氏、姬姆萨染料为 Ｓｏｌａｒｂｉｏ 公司产品；ＬＤＨ 检测试剂盒（货号 Ａ０２０－２）为南京建成生物工程研究所有限公司产品。
１．２　方法
１．２．１　 细胞培养　 
从液氮中取出永生化山羊子宫内膜上皮细胞（ＥＥＣｓ），３７ ℃快速复苏，低速离心后添加含 １０％ＦＢＳ、１００ Ｕ／ ｍＬ 青霉素和 １００ μｇ／ ｍＬ链霉素的 ＤＭＥＭ／ Ｆ１２ 培养基，置于 ３７ ℃、５％ ＣＯ ２饱和湿度的培养箱内培养。
１．２．２　 细胞分组与处理　 
取 １００ μＬ 浓度为 ５×１０ ４ 个／ ｍＬ的细胞悬液接种于 ９６ 孔培养板，２４ ｈ后弃去旧培养基，加入含不同浓度的百里香酚的完全培养液 １００ μＬ，百里香酚的终浓度分别为：０、１０、２０、４０、６０、８０、１００、１２０、１５０ μｇ／ ｍＬ，每个浓度设置 ８ 个复孔。
１．２．３　ＭＴＴ 检测百里香酚对细胞的增殖作用　 
继续培养 ４８ ｈ 后，观察细胞增殖情况。 弃去旧培养基，加入 ５ ｍｇ／ ｍＬ 的 ＭＴＴ ２０ μＬ，孵育 ４ ｈ。 弃去多余的 ＭＴＴ，每孔加入 ２００ μＬ 二甲基亚砜，低速振荡１０ ｍｉｎ，使结晶物充分溶解后在酶标仪上以 ５７０ ｎｍ检测各孔 ＯＤ 值，并以不含细胞的孔调零，记录各孔 ＯＤ 值， 计 算 细 胞 的 半 数 增 殖 抑 制 率（ＩＣ ５０ ）［１５－１６］ 。 以药物浓度为横坐标，细胞相对存活率为纵坐标，绘制曲线。Ａ ０ ：药物处理前 ＯＤ 值；Ａ １ ：对照组 ＯＤ 值；Ａ ２ ：药物处理 ４８ ｈ 后 ＯＤ 值；ＩＣ ５０ ＝（Ａ ２－Ａ０ ） ／ （Ａ １－Ａ０ ）×１００％
１．２．４　百里香酚对 ＥＥＣＳ 的形态的影响
取 １ ｍＬ浓度为 ５×１０ ４ 个／ ｍＬ 的细胞悬液接种于 １２ 孔培养板，培养 ２４ ｈ 后弃去旧培养基，加入含百里香酚终浓度为 ０、１００ 、１５０ μｇ／ ｍＬ 的完全培养液１ ｍＬ，每个浓度设置 ４ 个复孔。 继续培养 ４８ ｈ后收集细胞（１２００ ｒ／ ｍｉｎ，５ ｍｉｎ），加入 ５００ μＬ的无菌 ＰＢＳ 重悬细胞，涂片，晾干，放入预冷的甲醇溶液中固定 １５ ～ ３０ ｍｉｎ。 接着滴加 ２ ～ ３ 滴瑞氏染液，染色 ２～３ ｍｉｎ 后滴加等量的吉姆萨染液，染色 １０ ｍｉｎ。 每张涂片计数 １００ 个细胞，于显微镜下观察细胞形态 ［１７－１９］ 。
１．２．５　ＥＥＣｓ 细胞膜完整性的检测　 
取 ０．５ ｍＬ 浓度约为 ５×１０ ４ 个／ ｍＬ 的细胞悬液接种于 ２４ 孔培养板，培养 ２４ ｈ 后，弃去旧培养基。 分别加入含百里香酚 终 浓 度 为 ０、 １０、 ２０、 ４０、 ６０、 ８０、 １００、 １２０、１５０ μｇ／ ｍＬ的完全培养液 ０．５ ｍＬ，每组设三个重复孔。 继续培养 ４８ ｈ 后收集细胞上清液，６６００ ｒ／ ｍｉｎ，离心 １０ ｍｉｎ，严格按照 ＬＤＨ 检测试剂盒说明书操作，检测各组上清液中 ＬＤＨ 的含量。
１．２．６　 统计学方法　 
应用 ＳＡＳ ９．３０ 软件分析数据，Ｅｘｃｅｌ 绘图软件进行绘图。 结果以平均值±标准差表示，实验结果采用单因素方差分析进行统计学分析。

２　结果与分析
２．１　百里香酚对 ＥＥＣｓ 增殖的影响
结果发现，当百里香酚的浓度处在 １０ ～ １５０ μｇ／ ｍＬ 时，对 ＥＥＣｓ有增殖抑制作用。 随着药物浓度的升高对细胞的抑制作用越明显，且细胞的增殖抑殖率与药物的浓度 呈 一 定 的 线 性 关 系 （ ｙ＝－０．００８ｘ＋１．２２０２，Ｒ ２ ＝０．９７６７，如图 １）。 由此可计算，当细胞的增殖抑制率为 ０．５ 时（ＩＣ ５０ ），百里香酚的作用浓度为１００ μｇ／ ｍＬ。
２．２　 百里香酚对 ＥＥＣｓ 的细胞形态影响　 
正常的山羊子宫内膜上皮细胞多数为梭形，少数呈三角形，核圆居中，培养２４ ｈ 后，细胞交织成网状。 细胞贴壁良好，体积较大、折光性好，形态大小均匀一致（如 图 ３Ａ， 大 图 为 １００ ×， 小 图 为 ４００ ×）； 经１００ μｇ／ ｍＬ百里香酚处理 ４８ ｈ 后，ＥＥＣｓ 的密度增大，且在倒置显微镜下观察细胞生长状态良好（如图 ３Ｂ，大图为 １００×，小图为 ４００×）；由图 Ｃ 可以看出当百里香酚浓度达到 １５０ μｇ／ ｍＬ 时，作用相同的时间细胞出现死亡现象，细胞结构遭到破坏，细胞膜破裂，细胞核暴露，视野内有大量的细胞碎片存在（如图 ３Ｃ，大图为 １００×，小图为 ４００×）。

２．３　百里香酚对 ＥＥＣｓ 的细胞核形态影响
瑞氏－姬姆萨染色使细胞核呈深浅不同的紫红色，胞浆呈浅蓝色。 染色结果显示正常组和经１００ μｇ／ ｍＬ 的百里香酚作用 ４８ ｈ 的细胞的胞质和胞核界限清晰，胞核完整，胞浆均匀，细胞边缘完整，视野内未出现死亡细胞以及形态异常的细胞。 （如图 ４ａ，４ｂ，大图为 １００×，小图为 ４００×）。当百里香酚的浓度达到 １５０ μｇ／ ｍＬ 时，染色结果显示大部分细胞的细胞膜完整性遭到破坏。与正常细胞组相比，视野内少数细胞其细胞膜着色变浅，且细胞核多位于细胞膜边缘；大多数细胞的细胞膜完全消失，视野内只有紫红色的细胞核存在，但大多数细胞核结构完整，只有少量的细胞核发生破碎裂解。

２．４　百里香酚对 ＥＥＣｓ 细胞膜完整性的影响
测定结果显示：随着百里香酚浓度的升高，细胞培养液中 ＬＤＨ 的含量有升高的趋势，但不存在规律性增长。 且与对照组相比，当百里香酚的浓度大于 １００ μｇ／ ｍＬ 时细胞培养液中 ＬＤＨ 的含量显著升高（Ｐ＜ ０．０１）；与对照组相比 １０、２０、４０、６０、８０、１００ μｇ／ ｍＬ的百里香酚作用细胞后培养液中 ＬＤＨ的含量虽然升高，但不存在显著性差异（Ｐ＞ ０．０５），如图 ４ 所示。
３　讨　论
研究报道，通过阴道给药治疗妇科炎症具有可避免口服给药的首关效应和血药浓度的谷峰现象，避免药物对于胃肠道的刺激，避免注射给药的疼痛与心理恐惧，通过“ Ｆｉｒｓｔ ｕｔｅｒｉｎｅ－ｐａｓｓｅｆｆｅｃｔ ”能够将药物靶向传递到子宫内膜组织，因此，生物利用度高、药效显著 ［２０］ 。 百里香酚具有抗炎、调节免疫力、抗氧化、抗癌等多种生物活性，在临床治疗中具有较好的应用前景，在将来的研究中百里香酚可以被开发成一种新型的子宫灌注剂，采用阴道给药治疗奶牛等经济动物的子宫内膜炎。 那么，探明百里香酚对子宫内膜上皮细胞的刺激作用以及毒性作用是阐明其临床用药安全性的必要前提条件。 所以试验开展百里香酚对子宫内膜上皮细胞体外的毒活性研究，为百里香酚治疗奶牛等经济动物子宫内膜炎的临床应用提供理论依据。

活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的 ＭＴＴ 还原为难溶性的蓝紫色结晶物甲臜，并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。 甲臜被溶解后所测得的光密度值越小，说明细胞存活率越低 ［２１－２２］ 。本研究中 ＭＴＴ 的结果表明，百里香酚对 ＥＥＣｓ 的增殖抑制作用与其浓度成一定的关系，当浓度为１００ μｇ／ ｍＬ时达到 ＥＥＣｓ 的半数增值抑制率，因此可选用 ０～１００ μｇ／ ｍＬ 的百里香酚作用于 ＥＥＣｓ 行抗炎效果的研究。 而在梁德洁 ［２３］ 用百里香酚对ＬＰＳ 诱发的乳腺炎小鼠的保护作用及作用机制研究中选取百里香酚对小鼠乳腺上皮细胞无毒性影响的最大浓度为 ４０ μｇ／ ｍＬ。 这可能与百里香酚作用的细胞种类不同，细胞接种数量不同，实验操作不同等因素有关。

乳酸脱氢酶（ＬＤＨ） 是活细胞胞质内广泛存在的酶之一，正常情况下 ＬＤＨ 不能透过细胞膜，但当细胞膜受损或细胞死亡导致细胞膜通透性改变时，则会释放到培养液中，释放的 ＬＤＨ 与细胞膜的损伤程度或细胞死亡数成正比 ［２４］ 。 检测培养液中 ＬＤＨ 的含量可判断细胞膜的受损程度。 本研 究 结 果 显 示， 当 百 里 香 酚 的 浓 度 ≥１００ μｇ／ ｍＬ时细胞释放的 ＬＤＨ 含量显著升高，说明该浓度的百里香酚可显著引起细胞膜通透性增大。 此外，细胞生长状态和瑞氏－姬姆萨染色结果显示，１５０ μｇ／ ｍＬ 的百里香酚对 ＥＥＣｓ 的细胞膜能造成严重损伤，细胞膜破裂，细胞死亡。这一实验结果和之前的研究报道类似，Ｎｏｓｔｒｏ等 ［２５］ 研究也报道百里香酚可以抑制金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌的生物膜形成。 百里香酚可以通过影响细菌胞内 ｐＨ 稳态和无机离子平衡，从而破坏生物膜完整性对白色念珠菌产生抑制作用。 一步的研究表明，百里香酚可以增加小鼠平滑肌细胞胞膜去极化，导致肌质网 Ｃａ２＋离子释放，影响细胞膜的通透性 ［２６－２８］ 。 由此可见，百里香酚能够破坏细胞膜的完整性，而且这可能与药物被细胞膜的转运吸收有关。

Ｚｕ 等 ［２６］ 人研究证实，由于百里香精油对人类癌症细胞具有较强的细胞毒性，因此百里香精油也具有一定的抗癌作用。 其对ＰＣ－３、Ａ５４９ 和· ９ ３ 中国兽药杂志 ２０１７，５１（４）：３５～４１／ 闫宝琪，等ＭＣＦ－７肿瘤细胞株 ５０％抑制浓度（ＩＣ５０）分别为０．０１０％ （ Ｖ／ Ｖ ）、 ０．０１１％ （ Ｖ／ Ｖ ） 和 ０．０３０％（Ｖ／ Ｖ）。 此外香芹酚和百里香酚作为目前应用最为广泛的重要香料之一，被广泛应用于饲料添加以及一些口腔卫生品和洗涤物品 ［２７］ 。

４　结　论
百里香酚对山羊子宫内膜上皮细胞的安全剂量为≤１００μｇ／ ｍＬ，该剂量范围内药物对细胞活力和形态结构无显著影响；大于该剂量的百里香酚可显著增大子宫内膜上皮细胞的膜通透性，产生细胞毒性作用。 综上所述，百里香酚对细胞的毒性作用的研究为其治疗奶牛等经济动物的炎症性疾病，癌细胞的抑制作用，以及作为食品添加剂的安全使用剂量提供一定的理论依据和参考价值。
（参考文献略）