12种植物精油主要成分及对鸡源致病菌的抑菌作用研究

摘 要：研究 12 种植物精油的主要成分及其对 3 种常见鸡源致病菌( 鸡大肠杆菌、鸡白痢沙门菌及鸡金黄色葡萄球菌) 的抑制作用，采用微量二倍稀释法测定各精油对 3 种致病菌的最小抑菌浓度( MIC) ，在质量浓度0. 391 ～ 25. 000 mg /mL 内，各精油对各致病菌均表现出抑制活性，且百里香酚和香芹酚复配后的协同作用明显，为进一步对植物精油的开发利用提供科学依据。
关键词：植物精油; 最小抑菌浓度; 致病菌; 复配; 协同作用
作者：魏磊，李晓，王伟，王学方，郭唯，董建军

幼仔饲养已成为现代畜禽养殖业中最重要最关键的环节之一。幼仔的发病率及病死率很高，是由于其消化系统发育不健全，免疫力低下，加之各种应激反应所致。抗生素和化学合成抗菌药物的广泛应用明显改善了这种局面，但近年来引起畜禽产品的药物残留和耐药菌株产生的问题越来越为社会所关注，因此在当前饲料添加剂行业中，寻找和研究优质、安全、高效及稳定的抗生素替代品迫在眉睫［1 － 2］。近年来新型抗菌杀菌添加剂的研究越来越多，尤其是以天然植物提取物( 毒副作用低、无有害药残及不易产生抗药性等特点) 作为饲料添加剂备受重视。

研究表明，植物精油生物活性广泛，具有抗菌消炎、抗肿瘤、抗病毒、解热镇痛、祛痰止咳和改善胃肠功能等功效［3］。我国植物精油资源丰富，是一种很有开发潜力及应用前景的饲料添加剂，因此进行深入研究，开发兽用植物新产品具有较大的应用价值，且前景广阔。

研究对市售的 12 种植物精油，包括罗勒油、大蒜油、山苍籽油、蓝桉油、安息香油、柠檬草油、丁香油、百里香油、牛至油、肉桂醛、香芹酚和百里香酚进行主要成分检测和体外抑菌作用测试，并对它们间的相互作用进行研究，为畜禽用天然植物源杀菌剂的开发与应用提供理论依据。

1 材料与方法
1.1 试验材料与仪器
1.1.1 试验材料
12 种市售植物精油: 罗勒油、大蒜油、山苍籽油、蓝桉油、安息香油、柠檬草油、丁香油、百里香油、牛至油、肉桂醛、香芹酚和百里香酚; 3 种常见临床致病菌:鸡大肠杆菌 CVCC 1555、鸡白痢沙门菌 CVCC 1887和鸡金黄色葡萄球菌 CVCC 548，购自中国兽医药品监察所; 肉汤培养基和营养琼脂等均为国产; GC －MS 用甲醇为色谱纯试剂。
1.1.2 试验仪器
ME－204 电 子 天 平，无锡一净超净工作台，SYQ－DSX－280B 手提式压力蒸汽灭菌锅，Galaxy170S 生化培养箱等，GC－MS－QP2010Ultra气相色谱－质谱联用仪。
1.2 试验方法
1.2.1 12种植物精油 GC－MS 分析
色谱 柱 为 Ｒtx － 5Sil MS 弹性石英毛细管柱( 30. 00 m × 0. 25 mm，0. 25 μm) ; 升温程序，起始为 60 ℃，以 10 ℃ /min 升至 150 ℃，再以 6 ℃ /min升至 250 ℃，保留 10 min，进样口温度为 250 ℃ ;进样量 1. 0 μL，不分流; 载气为高纯度氦气，柱内载气流量为 1. 0 mL /min; 质谱用 EI 电离源，接口温度为280 ℃，电子能量 70 eV，离子源温度 230 ℃;扫描质量 35 ～ 600 aum; 倍增器电压 2 kV; 质谱检索标准库为 NIST11s. LIB 库。
1.2.2 药液制备
将乙醇 － 水( 1∶1) 作溶剂将上述 12 种植物精油配置成质量浓度为 200 mg /mL 的母液。
1.2.3 菌株复苏及菌悬液的制备
将上述 3 种供试菌种进行斜面复苏，复苏后接种于固体培养基上，培养 12 ～ 24 h。直接从平板上挑取已纯化的单个菌落，混悬于制备好的液体培养基中，制成浓度为 100 万 ～ 1 亿 CFU/mL 的菌悬液，备用。
1.2.4 单体植物精油最小抑菌浓度( MIC) 的测定
用微量二倍稀释法测定 12 种植物精油的 MIC。首先用 0. 22 μm 滤膜过滤 1. 2. 1 项的药液母液，作为样品原液。用制备好的液体培养基依次倍比稀释，稀 释 9 个 质 量 浓 度，即质量浓度依次为100. 000、 50. 000、 25. 000、 12. 500、 6. 250、 3. 125、1. 563、0. 781 和 0. 391 mg /mL。将稀释成不同质量浓度的药液依次加入微量MIC 测定板中，每孔 0. 1 mL; 分别加入已稀释好的各种菌液，每孔 0. 1 mL。每种分别设置阳性对照( 加入 0. 1 mL 菌液和 0. 1 mL 液体培养基) 和阴性对照( 只加液体培养基) 。制备好的微量 MIC 测定板于 37 ℃恒温箱中培养 24 h 观察结果，完全没有细菌生长时的最低浓度即为 MIC。
1.2.5 复配植物精油间协同作用的测定
根据单体植物精油 MIC 值，将肉桂醛、香芹酚和百里香酚按一定配比混合，配比和浓度见表 1。
用微量二倍稀释法测定复配药液对 3 种致病菌的MIC，再根据公式 1 计算 2 复配成分的部分抑菌浓度( FIC) 以判定它们间的相互作用。当 FIC≤0. 5 时 2 成分表现为协同，0. 5 ＜ FIC≤1 时为叠加，1 ＜FIC ＜ 2 时为不相关，FIC≥2 时为颉颃。
2 结果与分析
2.1 12 种植物精油主要成分分析结果
将 12 种植物精油分别溶于色谱甲醇中即为进样样品，按 “1. 2. 1”项 GC － MS 方法进行检测分析，主要成分及其百分含量见表 2。
2.2 单一植物精油的 MIC 测定结果
12 种植物精油对 3 种致病菌的 MIC 测定结果见表 3。结果表明，在质量浓度 0. 391 ～ 25. 000 mg /mL内，除大蒜油和安息香油外，各植物精油对各致病菌均表现出抑制活性。对于鸡大肠杆菌，各精油抑制作用的强弱为牛至油 ＞ 香芹酚 = 肉桂醛 ＞ 丁香油 ＞百里香酚 =百里香油 ＞ 罗勒油 = 山苍籽油 = 蓝桉油 =柠檬草油; 对于鸡白痢沙门菌，各精油抑制作用的强弱为牛至油 = 香芹酚 = 肉桂醛 ＞ 百里香酚 = 丁香油 ＞ 百里香油 ＞ 罗勒油 = 山苍籽油 = 蓝桉油 = 柠檬草油; 对于鸡金黄色葡萄球菌，各精油抑制作用的强弱为牛至油 = 香芹酚 = 肉桂醛 ＞ 丁香油 ＞ 百里香酚 = 百里香油 ＞ 罗勒油 = 山苍籽油 = 蓝桉油 = 柠檬草油; 因此，牛至油、香芹酚、百里香酚和肉桂醛具有较好的广谱杀菌活性。从主要成分看，它们主要成 分 分 别 为 76. 8% 香 芹 酚、83. 4% 香 芹 酚、95. 0% 百里香酚和 95. 2% 肉桂醛，因此选择香芹酚、百里香酚和肉桂醛 3 种精油进行复配研究。
2.3 复配植物精油间协同作用的测定
根据单一植物精油的抑菌结果，选择效果较好的香芹酚、百里香酚和肉桂醛进行复配，对 3 种致病菌的 MIC 测定结果和 FIC 计算结果见表 4。根据FIC 判定两复配精油间的相互作用: 对于鸡大肠杆菌，各复配组合表现出协同或叠加作用，其中百里香酚和香芹酚浓度比为 1 ∶ 1 复配时协同作用最强( FIC = 0. 28) ; 对于鸡白痢沙门菌、香芹酚和肉桂醛复配表现为不相关作用，百里香酚和香芹酚浓度比为 2∶1 复配时协同作用最强( FIC = 0. 41) ; 对于鸡金黄色葡萄球菌，只有百里香酚和香芹酚浓度比为2∶1 复配时表现为协同作用( FIC = 0. 37) ，其余复配组合均表现为叠加或不相关作用。综上所述，百里香酚和香芹酚复配对抑制 3 种致病菌可产生增效。
3 结论
我国植物精油资源丰富，已广泛应用于医药、食品、保健品和化妆品等行业，其作为天然高效的抑菌杀菌物质对革兰阴性菌和阳性菌均有较强的杀灭作用，因此，植物精油类产品作为抗生素的潜在替代品成为研究热点。研究 12 种市售植物精油( 罗勒油、大蒜油、山苍籽油、蓝桉油、安息香油、柠檬草油、丁香油、百里香油、牛至油、肉桂醛、香芹酚和百里香酚) 对 3 种鸡源常见致病菌( 大肠杆菌、鸡白痢沙门菌和金黄色葡萄球菌) 的抑制作用，在质量浓度 0. 391 ～ 25. 000 mg/mL内，除大蒜油和安息香油外，各植物精油对各致病菌均表现出抑制活性，这与胡艳芬等( 2010) ［4］; 王 改琴等( 2014) ［5］的试验结果相一致。
总的来说，牛至油、香芹酚、百里香酚和肉桂醛这 4 种植物精油抗菌效果最为明显，其主要成分分别为 76. 8% 香芹酚、83. 4% 香芹酚、95. 0% 百里香酚和 95. 2% 肉桂醛。不同植物精油的抗菌活性强弱不同，这与其含有的化学组分密切相关。据报道，植物精油组分抗微生物活性大小排序如下: 酚 类( 活性最高) ＞ 肉桂醛 ＞ 醇类 ＞ 醛类 = 酮类 ＞ 酯类 ＞碳氢化合物类［6 － 7］，这与试验结果相符合。
主要活性成分的抗菌机制已有初步研究。香芹酚和百里香酚互为同分异构体，它们改变了细菌表面蛋白的性质，增加菌体细胞膜的通透性，从而使细胞质中的离子流失及内外水分分配失衡致使细菌细胞死亡［8 － 10］。肉桂醛不影响细胞的结构［11］，其 分子中存在一个醛基，与苯环共轭，具有亲核性，易被细菌表面的亲水基吸附而穿入细胞壁，破坏细胞壁多糖结构从而产生抑菌或杀菌作用［12］。
对3 种效果明显的植物精油间的相互作用也进行研究，百里香酚和香芹酚复配后对 3 种致病菌均表现出较强的协同作用，具备开发成为一种复配植物源杀菌剂的潜能。